さて、今日の問題は「大腸菌における組換えタンパク技術」において、昨日の「2種の抗生物質選択」と並ぶ「Blue White Selection」という代表技術です。抗生物質は2種でなく1種のみ近い、別のもので選別します。 ★2013年麻布大獣医学部問題(一部改) 糖尿病の治療に使用されるinsulin製剤は、ヒトinsulin遺伝子を導入した組み換え 大腸菌により生産されている。ヒトinsulinタンパク質を生産する組換え大腸菌を 得るために次の手順で実験を行った。 ●ampRは抗生物質抵抗性遺伝子 ●X-galを加えると分解し、青色色素を作る酵素を作る遺伝子 実験1 図に示した大腸菌内で増殖するplasmidを 赤→の位置で制限酵素により切断した。 実験2 ヒトのgenomeDNAから制限酵素で切断して得た insulin遺伝子(I遺伝子)と ヒトのすい臓細胞に含まれる insulin遺伝子のmRNAから人工的に合成した DNA(U遺伝子)を、それぞれ実験1で切断された plasmidと結合させた。 実験3 作製した2種類のplasmidをそれぞれ大腸菌 に取り込ませた。 実験4 作製した組み換え大腸菌の中から目的のplasmidを持った大腸菌を選別した。 ★問1 DNA断片と切断したplasmidを結合させるために用いた酵素はどれか? @DNA ligase ADNA polymerase BDNA helicase C逆転写酵素 D制限酵素 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ @ ★問2 作製した組み換え大腸菌の中から、plasmidを持つものだけを選別することができる 寒天培地として適切なものを選べ。 @十分な栄養分が含まれる寒天培地 A特定の栄養素が欠如した寒天培地 Bampicillinが含まれる寒天培地 CampicillinとX-galが含まれる寒天培地 DX-galが含まれる寒天培地 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 答B 解説 plasmidが戻っていれば、ampicilinに対する抵抗性は共通にあるので、 plasmidが戻った大腸菌だけを選ぶならばampicilin培地で育ったものを選べばよい。 ★問3 作製した組み換え大腸菌の中から目的のDNAが組み込まれたplasmidを持つもの だけを選別することができる寒天培地をはどれか? @十分な栄養分が含まれる寒天培地 A特定の栄養素が欠如した寒天培地 Bampicillinが含まれる寒天培地 CampicillinとX-galが含まれる寒天培地 DX-galが含まれる寒天培地 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 答 C 解説 昨日のkanR遺伝子部位と同様、目的DNAが組み込まれたか否かを lacZの発現の有無で選別できるので「ampicilin+Xgal」が必要。 ★問4「ampicilin+Xgal」培地で育てると、下図のようにblueとwhiteのコロニーができた。どちらが遺伝子が組み込まれた大腸菌か? ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 答 White 解説 青が発色できるということは、lacZ遺伝子が破壊されていないのであるから「赤→」の部分に目的遺伝子が組み込まれていない。 白いコロニーのほうが、l赤→」の部分に目的遺伝子が組み込まれ、 遺伝子導入が成功したコロニーである。 一見、発色したほうが派手なので成功に見えるが、発色しないほうが成功であるので注意! 問5 実験4で得られたT遺伝子とU遺伝子が組み込まれた大腸菌のうち、正しく機能する insulinが合成されるのはどちらか一方のみである。その理由として適切なものを選べ。 @Tが組み込まれた大腸菌は遺伝子の一部をintronとして除去してしまうため。 ATが組み込まれた大腸菌はsplicingを行えないため。 BUが組み込まれた大腸菌はintronが除去されており、原核生物のribosome では正しくタンパク質合成ができないため。 CUが組み込まれた大腸菌の遺伝子はRNA polymeraseに認識されずmRNAが合成されない。 ↓ ↓ ↓ ↓ A 解説 ヒト遺伝子そのものを大腸菌に読ませるとsplicingを行えないので、intronまで読んでしまい、正しいinsulinが合成できない。 |